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活性炭在畜牧业上的应用—防止DON从肠道进入猪体内


[2015-05-27]

   

 
摘要:为了评估霉菌毒素吸附剂在动物体内的功效,根据欧洲的相关指南应该测量其特定的毒物代谢动力学参数。出于此目的,研究人员着重介绍了猪吸收模型的吸收动力学。在该模型中,试验猪单独或与活性碳(用作霉菌毒素的粘合剂)一起口服大丸粒霉菌毒素——呕吐毒素(DON)。在单独喂给呕吐毒素后,可从猪的血液中检测到了高水平的呕吐毒素,并用房室模型(compartmentalmodel)计算霉菌毒素在体内的动力学参数。活性炭能够彻底防止呕吐毒素的吸收,因为呕吐毒素与活性碳同时喂给猪后,未能从猪体内检测到该毒素。
关键词:呕吐毒素;吸收模型;猪;霉菌毒素粘合剂;效果测试
 
饲料污染霉菌毒素是一种能够导致动物生产性能损失的持续性饲料安全问题。因此,研究人员开发出了各种能够解除污染饲料加霉菌毒素的方法,但霉菌毒素解毒剂似乎是最有应用前景的方法,因此也是最常用的方法。这些解毒剂可分成两个不同的类型,即霉菌毒素粘合剂和霉菌毒素改性剂。这两种类型的去毒方法有着不同的作用方式:霉菌毒素吸附剂在动物肠道中吸附毒素,产生毒素——吸附剂复合物,并通过粪便排出;而霉菌毒素吸附剂能够将毒素改变成无毒性的代谢物。这些添加剂的大量使用导致欧盟于2009年设立了一个新的饲料添加剂组——霉菌毒素解毒剂。这些化合物被定为“可减少霉菌毒素对饲料污染的物质”能够抑制或减少毒素的吸收,促进霉菌毒素的排出,或改变它们作用模式的物质。
对这些产品的功效已经进行了大量的评估。体内效能试验通常是基于所谓的非特异性参数进行的,评估动物的生产性能、血液生化或血液参数、器官重量、对免疫功能的影响、组织学变化等。由于这些标准都具有非特异性,处理和未处理的动物之间产生的差异不能完全归因于解毒剂的功效。这中间有可能涉及到很多混合效应,如β-葡聚糖免疫调节活性及其他饲料成分的抗氧化作用。区分特定和非特定效应的一种可行方法是饲喂添加了解毒剂的无污染饲料。然而,欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)提出了基于特定动力学参数的其他端点。由于霉菌毒素吸附剂是在动物肠道中吸附霉菌毒素的,因此可以预期其在肠道中的吸收率较低。根据EFSA的要求,可以评估这些产品功效的最相关的参数是这些毒素或它们的主要代谢物在血浆中的浓度。EFSA提出了通过将霉菌毒素和解毒剂混合进饲料中再喂给动物进行短期的饲养试验。该霉菌毒素的血浆浓度和主要的代谢产物(多个),应在不少于5 d的一个阶段中和不短于一周(稳态设计)的采样前阶段中进行监测。此外,非特异性参数也需进行监测。这种饲养试验既花劳动力,又高投入。与此相反,利用毒物代谢动力学模型进行监测,将无须太多的劳动力和投入,在此模型中霉菌毒素单独或与解毒剂一起喂给试验动物。
本研究的目的是根据EFSA准则评估大丸粒吸收模型,以研究霉菌毒素解毒剂对口服摄入的呕吐毒素(DON)的解毒效应。
1 结果与讨论
试验猪在按每千克体重单次口服0.05 mgDON后,测定其血液中可量化的DON水平(图1)。结果发现,在吸收参数上,公猪和母猪之间未观察到统计学上的差异(数据未显示)。血浆浓度-时间曲线拟合符合房室模型(compartmental model)。1.33 h的Tmax值与Goyaerts和Dänicke(2006)报道的1.65 h相当。另一方面,29.7mg/mL的Cmax值相对高于Goyaerts和Dänicke (2006)的结果(每千克体重口服0.08 mgDON后,血液中浓度为15.1 mg/mL)。然而,采食量可以影响DON的口服获得量,这可以解释在本研究中禁食猪的Cmax值高于Goyaerts和Dänicke(2006)所获结果的原因。DON的其他动力学参数接近Goyarts等(2006)和Dänicke等(2004)的研究结果。本研究未能在血液中检测到DON的主要代谢产物——脱环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DOM-1)。这与先前的文献报道相关,该文献报道在猪全身血液循环中DOM-1占总DON浓度的1.4 %~1.7 %。血浆DON浓度/ ng/mL。
  为了检验猪的这一模型的效力,DON还与活性炭(AC)一起饲喂,因为研究表明它在肉鸡体内能够强烈地吸附DON。DON的吸收完全被活性碳阻断,因为在血清中未能检测到高于检测限(LOD)的DON。这表明此吸收动力学模型适用于评估霉菌毒素吸附剂对猪口服DON的吸收阻断效果。如上所述,AC可以用作阳性对照,因为它是一种常用的解毒剂,可吸附多种化合物,包括霉菌毒素,如DON。然而,活性碳的商业应用应该避免,以便尽量减小降低营养吸收率和损害饲料营养价值的风险。
 
表1  呕吐毒素(DON)单独饲喂仔猪后(0.05 mg/kg 体重,N=4)
主要的吸收动力学参数(数值以“平均值±SD”的方式表示)
动力学参数
DON
Cmax/ ng/mL)
29.73±6.847
Tmax/ h
1.33±0.802
AUC0-inf/ ng.h/mL
168.62±22.682
ka/ h-1
3.87±2.95
T1/2a/ h
0.66±0.650
kel/ h-1
0.26±0.048
T1/2ELel/ h
2.73±0.477
Vd/F/ L/kg
1.19±0.024
Cl/F/ L/H/kg
0.30±0.042
注:Cmax=血浆中DON的最高浓度,Tmax=口服后到血浆中DON达到最高浓度的时间,AUC0-inf=处于血浆浓度-时间曲线下口服DON起至无穷大时间之间的面积,ka=吸收速率常数,T1/2a=吸收半反应期,kel=消除速率常数,T1/2el=消除半反应期,口服量平均分配容积=Vd/F,口服量平均解除速率=Cl/F。
2  试验材料
2.1 化学药品、产品和药剂
用于此动物分析试验的标准DON购自以色列的Fermentek公司。DOM-1购自比利时的Sigma-Aldrich公司。内标物(Internal standard,IS) 13C15-DON购自澳大利亚的Biopure公司。这些标准物储存在-15 ℃以下的环境中。试验所用的水、甲醇和乙腈(ACN)为LC-MS级,购自荷兰的Biosolve公司;冰醋酸为分析纯,购自比利时VWR公司;Millex®-GV-PVDF滤波器(0.22μm)购自比利时Merck-Millipore公司。
2.2 试验动物
8头体重20.2 kg±1.4kg的混合性别仔猪购自比利时BiocentreAgrivet公司,并饲养在四个不同的猪栏中(±4 m2/间,2头/间),猪栏温度保持在18 ℃~25 ℃,相对湿度为40 %~80 %之间。猪舍采用环境自然光照方案。试验猪经一周适应驯化期后,禁食12 h,随后按每千克体重0.05 mg的剂量,用胃管强制性一次口服DON。这一剂量相当于每千克饲料污染1mg DON的水平。试验所用DON为大丸药,先溶于乙醇(1 mg/mL)中,并用饮用水进一步稀释到10 mL。4头试验猪服用这些DON大丸药和活性炭(AC)(剂量:0.1 g/kg体重,类似于饲料中2 g/kg的添加量),悬浮在10 mL饮用水中。服用后,胃管立即用50mL饮用水冲洗。血液样本于DON口服前(0 min)和口服后0.33、0.66、1、1.5、2、3、4、6、8、10和12 h取样。采取的血样置于含有肝素的试管中,并在离心力2851×g和温度4℃下离心10 min。血样按每份250μL进行等分,随后储存在≤-15℃下备用。
2.3 DON的血浆定量
血样按Devreese等所述的方法进行分析。简言之,将12.5μL内标物和750μL乙腈加入250μL的血浆中,随后进行涡旋混合(15 min)和离心(8517×g、10 min、4℃)。接着,上清液转移到另一试管中,使用温和的氮气(N2)气流蒸发(45℃±5℃)。干的残留物用200μL的水/甲醇液(85/15,体积/体积)重新配制成原有的浓度。经涡旋混合(15 min)后,样本经过Millex®GV-PVDF过滤器(0.22μm)转移到一个自动采样瓶中。等分试样(5μL)并注射到LC-MS/MS仪器中。LC系统由一个配有真空脱气装置的四级低压混合泵和一个带有温控的托盘和色层分析柱加热器的自动取样器组成。色谱分离用Hypersil®金柱(内径50 mm×2.1 mm,粒径1.9μm)结合同一类型的保护柱(内径10 mm×2.1 mm,粒径3μm)完成。梯度洗脱程序用含0.1%冰醋酸的水-甲醇流动相进行。LC柱流出物被接入到TSQ®Quantum Ulta三重四极质谱仪中,该质谱仪配备有加热的电喷射离子化(heated ElectrosprayIonization,h-ESI)探针,可在负离子化模式下操作。随后对选择反应监测(Selected ReactionMonitoring,SRM)转换进行监测,并用于识别和量化,分别为:DONM/Z 355.1>265.2和355.1> 295.1,为DOM-1M/Z339.1> 459.1和339.1>249.0和13C15-DONM/Z 370.1> 279.2和370.1> 310.1。DON和DOM-1的定量极限(Limit Of Quantification,LOQ)分别为1和2μg/mL,而检测极限(Limit Of Detection,LOD)分别为0.05ng/mL和0.04 ng/mL。
2.4 吸收参数
用WinNonlin6.3(Pharsight公司,美国密苏里州圣路易斯)软件对吸收参数进行分析,分别计算DON的最重要参数:最大血浆浓度(Cmax),口服后到血浆中DON达到最高浓度的时间(Tmax),处于血浆浓度-时间曲线下方从口服DON时起至无穷大时间之间的面积(AUC0-inf),吸收速率常数(ka),吸收半反应期(T1/2a),消除速率常数(kel),消除半反应期(T1/2el),口服活量的平均分配容积(Vd/F)和口服量的平均解除速率(Cl/F)。
3  结论
本研究是动物营养界有史以来第一次利用体内模型,根据霉菌毒素吸收动力学来评价活性炭对猪口服呕吐毒素的解毒效率。结果表明活性炭能够完全防止DON从肠道进入猪体内。
原题名:Efficacy of Active Carbontowards the Absorption of Deoxynivalenol in Pigs(英文)
原作者:Mathias Devreese、Gunther Antonissen、Patrick De Backer和SiskaCroubels

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